【团体标准】 兽用中药材香菇

1性状按照《中华人民共和国兽药典》二部附录“药材和饮片检定通则”，以及13批来源于福建、四川、安徽、陕西、浙江、湖北等不同产地的香菇药材（见表2）实际性状在自然光下观察样品外形、色泽、表面特征、剖面，测量菌盖直径、菌柄的长度与粗细，并嗅其气味、口尝味感。各样品的外观见图1。表2香菇样品种类及等级样品号产地种类等级样1浙江厚菇一级样2浙江厚菇二级样3浙江花菇一级样4浙江薄菇一级样5浙江薄菇二级样6福建古田花菇特级样7福建古田厚菇一级样8四川青川花菇一级样9四川青川厚菇二级样10浙江薄菇等外样11安徽厚菇一级样12陕西厚菇一级样13湖北花菇特级图1各样品实物图片根据不同来源的香菇外观观察，确定性状如下：子实体菌盖直径在3cm～12cm之间，半球形或扁平球形至稍平展。表面菱色、浅褐色、深褐色至深肉桂色，有深色鳞片，有的有天然裂纹，菌肉白色，细密。菌褶白色，密、弯生、不等长。干品菌柄中生至偏生，白色，常弯曲，长0.8cm～3cm，直径0.5cm～1cm，内实，纤维质。有香菇特有香味，微甘。2菌丝、孢子显微鉴别按照《中华人民共和国兽药典》二部附录显微鉴别法（2001）执行。2.1仪器设备生物显微镜。2.2试剂或材料除非另有规定，仅使用分析纯试剂。水：符合GB/T6682，一级。水合氯醛。甘油。水合氯醛试液制备：取水合氯醛50g，加水15mL与甘油10mL使溶解，即得。2.3分析步骤取本品少量，置载玻片上，摊平，选用水合氯醛试液，用酒精灯加热至泡沸，反复2次，放冷后，盖上盖玻片，置显微镜下观察，即得。13批不同来源的香菇均具有如下共性显微特征：菌丝众多，无色透明，具有分支和横隔孢子椭圆形，有时一端稍尖，无色，壁表面光滑，长5μm～7μm，宽3μm～4μm。显微特征见图2。图2菌丝、孢子显微特征(400×)从左至右依次为厚菇、花菇、薄菇3木糖、半乳糖、葡萄糖鉴别按照《中华人民共和国兽药典》二部薄层色谱法（附录0502）执行。本标准从香菇中提取多糖，并将多糖水解成单糖，通过薄层色谱法检出特有的单糖组成，用于香菇的鉴别。十三批不同来源供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，均显相同颜色的斑点。对方法进行了稳定性、重复性、专属性试验，结果证明该方法可行。3.1方法学验证3.1.1香菇多糖的制备将香菇样品粉碎成粗粉，称取粉末20g±2g，加水400mL，煎煮60min，过滤，滤渣再加水300mL，煎煮60min，过滤，合并滤液，浓缩至40mL左右（室温），加入乙醇使含醇量达60%，边加边搅，静置过夜，过滤，取沉淀，先加60%乙醇50mL洗涤，再加适量95%乙醇洗涤，60℃真空干燥，得多糖样品。3.1.2溶液制备单糖溶液称取半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖，分别溶于水中，制得5种单糖溶液，浓度均为5.0mg/mL。混合糖溶液分别取上述5种单糖溶液，等量混合，制得混合糖溶液。显色剂苯胺-二苯胺-丙酮溶液（将2g二苯胺、2mL苯胺溶于100mL丙酮中，再加入10mL85％磷酸）。展开剂展开剂1：正丁醇-吡啶-水（10:4:6）；展开剂2：乙酸乙酯-甲醇-乙酸-水（13:3:3:1）；展开剂3：乙酸乙酯-乙醇-吡啶-水（8:2:2:1）。3.1.3展开剂的选择将各单糖溶液3μL、混合糖溶液5μL分别点于同一硅胶H薄层板上。同法点3块相同薄层板。分别置3种不同展开剂中，斜向上行展开，晾干，喷显色剂，置85℃，烘10分钟。结果，只有展开剂3可将5种单糖完全分离（见图3），故选用展开剂3。1：混合单糖；2：半乳糖；3：葡萄糖；4：阿拉伯糖；5：木糖；6：鼠李糖图3展开剂的选择3.1.4硅胶薄层板的选择将各单糖溶液3μL、混合糖溶液5μL分别点于同一硅胶H薄层板（10cm×20cm），同法再点于硅胶G薄层板（10cm×20cm）以及硅胶G薄层板（10cm×10cm）上，分别置展开剂3中，斜向上行展开，晾干，喷显色剂，置85℃，烘10分钟。结果，硅胶H薄层板（10cm×20cm）分离效果最好（见图4）。故继续试验选用硅胶H薄层板（10cm×20cm）。1：混合单糖；2：半乳糖；3：葡萄糖；4：阿拉伯糖；5：木糖；6：鼠李糖图4硅胶薄层板的选择3.1.5香菇多糖水解液中单糖组分确认多糖水解液的制备取香菇多糖样品0.1g，加1moL/L硫酸溶液6.5mL，密封，置水浴中水解4小时，取出，放冷，加碳酸钡（固体）中和至中性，滤过，滤液作为多糖样品水解液。层析分离将样1、样2、样3、样4、样5多糖样品水解液各5μL、混合糖溶液5μL、各单糖溶液3μL点于同一硅胶H薄层板（10cm×20cm）上，分别置展开剂3中，斜向上行展开，晾干，喷显色剂，置85℃，烘10分钟。结果各多糖样品水解液的色谱中均可见3个斑点，且分别与半乳糖、葡萄糖、木糖相对应（见图5）。表明用本方法试验可检出香菇多糖的单糖组分——半乳糖、葡萄糖、木糖。左图：1：样1多糖水解液；2：样3多糖水解液；3：混合单糖；4：半乳糖；5：葡萄糖；6：阿拉伯糖；7：木糖；8：鼠李糖右图：1：混合单糖；2：样2多糖水解液；3：样4多糖水解液；4：样5多糖水解液；5：鼠李糖；6：木糖；7：阿拉伯糖；8：葡萄糖；9：半乳糖图5香菇多糖水解液中单糖组分确认3.1.6重复性试验取样1，按3.1.1方法制备多糖，按3.1.5方法制备多糖水解液，以葡萄糖溶液、半乳糖溶液、木糖溶液为对照品液。分别取多糖水解液、对照品液各3μL点于同一硅胶H薄层板（10cm×20cm）上，按3.1.5试验。上述操作重复4次。结果，各样品多糖水解液色谱中均有3个与对照品液对应的斑点（见图6），表明本方法重复性较好。1：葡萄糖；2：半乳糖；3：木糖；4：样1多糖水解液图6重复性试验3.1.7定性试验按上述方法制备样1多糖水解液，冷藏备用。用同一样品水解液按3.1.5法进行层析试验，1天1次，连续5次。结果，所有样品水解液色谱中均有3个分别与葡萄糖、半乳糖、木糖对照品对应的斑点。说明样品水解液制备后，在5天内试验，结果稳定。3.1.8专属性试验取样1多糖水解液。另取相同样品多糖0.1g,加水6.5mL，水浴溶解，作样1多糖溶液。另取市场中多见的多糖类产品——黄芪多糖（鹿邑神农植物科技发展有限公司）按3.1.5法制备黄芪多糖水解液。取样1多糖水解液、样1多糖溶液、黄芪多糖水解液各3μL、对照品液各3μL点于同一硅胶H薄层板（10cm×20cm）上，进行层析试验。结果，样1多糖水解液有3个与对照品液对应的斑点，样1多糖溶液无斑点，黄芪多糖水解液只有葡萄糖对应斑点（见图7）1：样1多糖水解液；2：样1多糖溶液3：黄芪多糖水解液；4：半乳糖；5：葡萄糖；6：木糖图7专属性试验3.1.9香菇样品鉴别取样1～样13共13个样品，分别按3.1.1方法制备多糖，按3.1.5方法制备多糖水解液。分别取样品多糖水解液、半乳糖、葡萄糖、木糖对照品液各3μL点于同一硅胶H薄层板（10cm×20cm）上，进行层析试验。结果，所有样品供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，均显相同颜色的斑点（见图8）。1：葡萄糖；2：半乳糖；3：木糖图8各样品多糖水解液色谱图4水分按照《中华人民共和国兽药典》二部水分测定法（附录0832）第一法执行。结果见表3。表3香菇水分测定结果表香菇样品号来源水分（%）样1浙江产，厚菇，一级9.36样2浙江产，厚菇，二级9.56样3浙江产，花菇，一级10.03样4浙江产，薄菇，一级10.63样5浙江产，薄菇，二级10.59样6福建古田产，花菇，特级10.93样7福建古田产，厚菇，一级9.65样8四川青川产，花菇，一级9.82样9四川青川产，厚菇，二级10.05样10浙江产，薄菇，等外10.11样11安徽厚菇一级9.56样12湖北花菇特级9.38样13陕西厚菇一级10.05结果表明：13批次香菇水分平均值9.99%，符合GH/T1013-1998《中华全国供销合作总社行业标准香菇》中水分≤13.0%的规定，参考此标准，加之考虑到产地、加工等及实验室间检测误差等因素，将水分的限度确定为：≤13.0%。5总灰分按照《中华人民共和国兽药典》二部附录灰分测定法(2302)总灰分测定法执行，【总灰分】项中取样量为3.0g，相当于香菇粉末3.0g，确定取样量为3.0g。其他按附录2302总灰分测定法执行。结果见表4。表4香菇总灰分测定结果表香菇样品号来源总灰分（%）样1浙江产，厚菇，一级5.76样2浙江产，厚菇，二级4.76样3浙江产，花菇，一级2.76样4浙江产，薄菇，一级2.96样5浙江产，薄菇，二级4.98样6福建古田产，花菇，特级2.99样7福建古田产，厚菇，一级3.56样8四川青川产，花菇，一级3.12样9四川青川产，厚菇，二级5.02样10浙江产，薄菇，等外5.85样11安徽厚菇一级2.98样12湖北花菇特级2.93样13陕西厚菇一级3.66结果表明：香菇总灰分均在6.0%以下，均未超过GH/T1013-1998《中华全国供销合作总社行业标准香菇》中灰分≤7.0%的规定，参考此标准，加之考虑到产地、加工和实验室间误差等因素，将总灰分的限度确定为：≤7.0%。6特征图谱为了保证香菇多糖的研究及提取生产时原料质量的稳定，本标准进行了“香菇中多糖组分的特征图谱研究”,试料中的多糖组分，采用高效分子排阻色谱法进行分离，不同分子量的多糖相对保留时间不同，从而建立香菇多糖组分的特征图谱。6.1试剂或材料除非另有规定，仅使用分析纯试剂。水：符合GB/T6682，一级。磷酸二氢钾。无水乙醇。95%乙醇。D-无水葡萄糖对照品：含量测定用。0.02mol/L磷酸二氢钾溶液：取磷酸二氢钾2.72g，用水稀释至1000mL。60%乙醇：取无水乙醇60mL，用水稀释至100mL。参照物溶液的制备：取D-无水葡萄糖对照品（CAS:50-99-7,纯度：99.9%）50mg，精密称定，置100mL量瓶中，加0.02mol/L磷酸二氢钾溶液使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。6.2仪器设备高效液相色谱仪：配示差折光检测器；色谱柱：凝胶色谱柱，G4000PWxl，7.8mm×300mm，10μm，或性能相当者；分析天平：感量0.1mg，0.01mg；真空干燥箱:真空度0.1MPa，精度±1℃；旋转蒸发仪。6.3液相色谱参考条件流动相：0.02moL/L磷酸二氢钾溶液。流速：0.6mL/min。柱温：30℃。6.4供试品溶液的制备将香菇样品粉碎成粗粉，称取粉末20g±2g，加水400mL，煎煮60min，过滤，滤渣再加水300mL，煎煮60min，过滤，合并滤液，浓缩至40mL左右（室温），加入乙醇使含醇量达60%，边加边搅，静置过夜。过滤，取沉淀，先加50mL60%乙醇洗涤，再加适量95%的乙醇洗涤，60℃真空干燥，即得。称取提取的香菇多糖30.0mg，精密加入流动相10mL，密封，水浴溶解，0.45μm微孔滤膜过滤，得供试品溶液。6.5分析方法验证6.5.1精密度试验按上述色谱条件，取参照物溶液，连续5次进样，分别记录30min，葡萄糖色谱峰的保留时间、峰面积见表5，RSD分别为0.02%、0.95%，表明系统的精密度较好。色谱图见图9。表5精密度试验结果进样序号12345RSD(%)保留时间17.78517.78617.78917.79117.7950.02峰面积1419021443061456631438591445390.95图9精密度试验色谱图6.5.2稳定性试验取供试品溶液，分别在0h，2h，4h，6h，8h，12h进样测定，以参照物溶液的葡萄糖峰为参照，考察色谱中第一个峰（峰1）和第二个峰（峰2），分别计算相对于外标葡萄糖峰的相对保留时间。结果显示，供试品溶液配制后12h内进样检测，2个多糖峰的相对保留时间均无显著变化，RSD在0.1%以下，表明方法稳定性良好。结果见表6及图10。表6稳定性试验结果进样时间（h）相对保留时间峰1峰2峰3峰4峰500.51080.61550.85020.93100.982920.51090.61580.85150.93080.982840.51090.61610.85180.93030.982960.51110.61640.85210.93050.983380.51180.61640.85190.93050.9835表6（续）120.51140.61590.85160.93030.9833RSD(%)0.080.060.080.030.03图10稳定性试验色谱图6.5.3重复性试验取供试品溶液，在上述色谱条件下，分别进样测定，计算各色谱峰相对于外标葡萄糖峰的相对保留时间及峰1、峰2相对峰面积，考察各供试品溶液间的变化。结果见表7及图11。峰1、峰2、峰3、峰4相对保留时间的RSD分别为0.31%、0.38%、0.31%、0.05%，峰1、峰2相对峰面积的RSD分别为8.16%、6.07%。表7重复性试验结果进样相对保留时间相对峰面积序号峰1峰2峰3峰4峰1峰210.51210.58890.86760.98701.04972.005820.51290.59360.86610.98811.14452.325230.51440.59000.86470.98791.30142.190740.51000.58830.86170.98821.11752.244850.51270.59220.86150.98761.20372.3394RSD(%)0.310.380.310.058.166.07图11重复性试验色谱图6.5.4样品测定分别取13批不同来源的香菇，照6.4制备供试品溶液，在上述色谱条件下，分别进样，记录色谱图。结果显示，13批供试品色谱中均呈现4个特征峰，4个特征峰的相对保留时间均在规定值的±5%之内，规定值为：0.508（峰1）、0.618（峰2）、0.866（峰3）、0.988（峰4）。结果见表8及图12。表813批样品中各色谱峰相对保留时间样品号相对保留时间峰1峰2峰3峰410.51930.61790.85750.987620.51080.61550.85020.982930.51350.61480.86610.986040.49470.63420.85930.993450.49230.63530.86970.991860.51170.60340.85830.983770.50100.66520.85980.983280.52480.61340.88861.011790.51850.64060.87170.9908100.48540.62920.86180.9835110.50810.58670.86690.9842120.50650.58860.87200.9848130.51210.58890.86760.9870均值0.50760.61800.86560.9885RSD(%)2.263.731.130.79图12各供试品溶液色谱图7含量测定糖类物质在浓硫酸作用下脱水，生成糠醛或糠醛的衍生物，糠醛能与芳香族化合物缩合生成红色化合物，该有色化合物在490nm有最大吸收，测定490nm处的吸光度，就能计算出多糖浓度。用本方法测出的粗多糖含量结果更能反映用于提取香菇多糖的原料质量优劣。因此为了有效控制产品质量，粗多糖含量以无水葡萄糖计作为质量控制指标。本标准试验方法参照并引用了中华人民共和国农业行业标准NY/T1676-2023《食用菌中粗多糖的测定分光光度法》含量测定项下样品制备。7.1试剂或材料除非另有规定，仅使用分析纯试剂。水：符合GB/T6682，一级。无水乙醇。硫酸。苯酚。D-无水葡萄糖对照品：含量测定用。80%乙醇：取无水乙醇80mL，用水稀释至100mL。苯酚蒸馏：将苯酚置于80℃的水浴中溶解，然后将一定量的苯酚移至蒸馏瓶中。放入玻璃珠数粒，于182℃蒸馏，弃去最初2min～3min蒸馏液，收集随后的蒸馏液，待冷却后备用。5%苯酚：重蒸馏过的苯酚5mL，用水稀释至100mL。现用现配。对照品溶液的制备：取D-无水葡萄糖对照品（CAS:50-99-7,纯度：99.9%）10mg，精密称定，置100mL量瓶中，加水使溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取5mL，置10mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。7.2仪器设备紫外分光光度计:精度±0.3nm,波长范围190nm～1100nm；分析天平：感量0.1mg，0.01mg；离心机：转速不低于5000rpm；真空干燥箱:真空度0.1MPa，精度±1℃。7.3试验步骤7.3.1试液制备取本品粉末（过三号筛）0.5g±0.05g，精密称定，置50mL三角烧瓶中，用5mL水浸润，缓慢加入20mL无水乙醇，混匀，置超声提取器中提取30min。4000rpm离心10min，弃去上清液。沉淀用80%乙醇溶液10mL洗涤，同法离心。用50mL水将沉淀转入圆底烧瓶中，置水浴中回流提取2h。放冷，过滤，残渣用水洗涤2～3次，合并滤液转移至1000mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。7.3.2定量测定精密量取试液及对照品溶液各1mL，分别置20mL具塞试管中，精密加5%苯酚1.0mL，摇匀，再迅速精密加5mL硫酸，立即混匀，放置10min。置30℃水浴中反应20min，取出，放置至室温，以相应试剂作空白参比，在490nm波长处测定吸光度，即得。7.4分析方法验证7.4.1线性标准曲线的制备：精密吸取浓度为0.1mg/mL的对照品溶液0、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL，分别置20mL玻璃试管中，用水补至1.0mL。得浓度分别为0μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL，向试管中精密加入5%苯酚溶液（临用现配）1.0mL，摇匀，迅速精密加入5.0mL浓硫酸与液面垂直加入，勿接触试管壁），静置10min，用旋涡震荡器使反应液充分混合，然后将试管置于30℃水浴中反应20min,迅速冷却，转移至1cm比色皿中，在490nm处测定吸光度值。吸光度值为纵坐标，以葡萄糖的质量为横坐标，绘制标准曲线。结果表明：无水葡萄糖在浓度为0-100μg/mL范围内，线性关系均良好。结果见表9与图13。表9线性试验结果表组分对照品浓度(μg/mL)吸光度（A）线性关系无水葡萄糖00y=9.0382x-0.0181，R=0.9993200.181400.361600.542800.7231000.902图13标准曲线7.4.2重复性分取同一批号样品6份，按7.3.2测定含量。结果表明：无显著差异，方法重现性良好。结果见表10。表10重复性试验结果表序号取样量（g）粗多糖含量（%）10.50529.6120.50189.3230.50369.5140.50089.7150.50969.8760.50419.62平均//9.61RSD(%)//1.937.4.3回收率精密称取自制产品（主产地药材），批号：23040801，约0.25g，共9份，分别置9个具塞锥形瓶中，照7.3.1操作，在圆底烧瓶中均精密加入无水葡萄糖对照品0.018g、0.022g、0.026g照7.3.2测定。结果表明：回收率都在90%~110%之间，验证结果合格。结果见表11。表11回收率试验结果表取样量（g）样品含量（g）加入量（mg）测得总量（g）回收率%平均值%RSD%0.25010.022190.0180.04025100.398.31.40.25040.022200.0180.0398498.00.25050.022140.0180.0400799.60.25160.022300.0220.0440098.60.25320.022470.0220.0441898.70.25070.022130.0220.0439899.30.25040.022130.0260.0471996.40.25050.022160.0260.0475197.50.25160.022330.0260.0473496.27.5样品含量测定按照7.3.2测定含量。结果见表12。表12含量测定结果表香菇样品号来源粗多糖含量（%）样1浙江产，厚菇，一级8.6样2浙江产，厚菇，二级8.0样3浙江产，花菇，一级12.0样4浙江产，薄菇，一级7.5样5浙江产，薄菇，二级7.0样6福建古田产，花菇，特级12.0样7福建古田产，厚菇，一级6.4样8四川青川产，花菇，一级12.4样9四川青川产，厚菇，二级14.2样10浙江产，薄菇，等外6.2表12（续）样11安徽厚菇一级9.6样12湖北花菇特级14.3样13陕西厚菇一级8.7结果表明：13批香菇药材按干燥品计算,平均含量为9.76%，考虑到药材的来源及质量差异，以及药材生产储藏等因素的影响，在平均值的基础上下调至80%，限度确定为：不得少于7.8%。由于本方法所测为水溶性多糖，故限量标准低于GH/T1013-1998《中华全国供销合作总社行业标准香菇》规定的总糖含量。8贮存和保质期8.1贮存取自制香菇（主产地药材），批号：23040801，按照《中华人民共和国兽药典》一部原料药物与制剂稳定性试验指导原则（附录9001）执行，进行稳定性研究影响因素试验，包括高温、高湿及强光照射试验。结果见表13。表13样品稳定性试验影响因素试验结果表影响因素时间（天）性状吸湿性（%）粗多糖变化率（%）//0浅褐色00.00高温5深褐色减重3.810.2110深肉桂色减重4.350.16高湿（75%）5浅褐色增重23.290.2810浅褐色增重25.620.18强光5深褐色减重1.340.3110深肉桂色减重1.480.28结果表明：本品吸潮，同时在高温及强光照射下，性状易发生改变。因此本品应密封贮存在阴凉、干燥处。8.2保质期各企业自行规定。