【团体标准】 兽用中药材茯苓

1性状根据《中华人民共和国兽药典》二部茯苓的质量标准，以及7批来源于湖北、湖南、河南、安徽、贵州、云南、广西、浙江等不同产地的茯苓药材实际性状，确定性状为：茯苓个：呈类球形、椭圆形、扁圆形或不规则团块，大小不一。外皮厚而粗糙，棕褐色至黑褐色，有明显的皱缩纹理。体重，质坚实，断面颗粒性，有的具裂隙，外层淡棕色，内部白色，少数淡红色，有的中间抱有松根。气微，味淡，嚼之粘牙。茯苓块：为去皮后切制的茯苓，呈立方块状或方块状厚片，大小不一。白色、淡红色或淡棕色。茯苓片：为去皮后切制的茯苓，呈不规则厚片，厚薄不一.白色、淡红色或淡棕色。2菌丝显微鉴别按照《中华人民共和国兽药典》二部茯苓【鉴别】项（1）测定。三批不同产地的茯苓均能检出无色不规则颗粒状团块和分枝状团块，遇水合氯醛液渐溶化。菌丝无色或淡棕色，细长，稍弯曲，有分枝，直径3μm～8μm，少数至16μm，显微特征见图1。图1不规则颗粒状团块和分枝状团块(400×)3多糖鉴别按照《中华人民共和国兽药典》二部茯苓【鉴别】项（2）测定。分别取三批不同产地的茯苓粉末少量，加碘化钾碘试液1滴，均显深红色。4茯苓鉴别按照《中华人民共和国兽药典》二部板茯苓【鉴别】项（3）测定。对三批不同产地的茯苓试验结果表明，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点。结果见图2。图21.茯苓对照药材2-4依次批号20231001、20231002、20231003样品三批不同产地的茯苓均符合规定。5水分按照《中华人民共和国兽药典》二部附录0832干燥失重测定法测定。结果见表1。表1三批样品水分测定结果批号水分（%）平均值（%）RSD%（n=6）202310019.289.249.319.20.318.949.079.17202310028.878.798.999.00.919.318.919.04202310039.109.158.849.11.59.209.179.04批间均一性9.1RSD=1.8%（n=18）三批样品中的水分平均值为9.1%，符合兽药典不能超过18.0%的规定。试验结果表明，批内均一性、批间均一性均符合要求，证明本品工艺稳定。结合兽药典的规定、实测值并考虑实验室间的误差，水分标准在平均值的基础上上调至130%左右，确定水分≤12.0%。6总灰分按照《中华人民共和国兽药典》二部附录2302测定。结果见表2。表2三批样品总灰分测定结果批号总灰分（%）平均值（%）RSD(%)202310010.8980.9170.9250.911.60.9210.9320.892202310020.9690.9450.9270.952.40.9530.9310.992202310030.9430.9620.9860.963.00.9220.9521.01批间均一性0.94RSD=3.3%（n=18）三批样品中的灰分平均值为0.94%，符合兽药典不能超过2.0%的规定。试验结果表明，批内均一性、批间均一性均符合要求，证明本品工艺稳定。考虑实验室间检测误差等因素，灰分标准在平均值的基础上上调至150%左右，定为灰分≤1.5%。7浸出物按照《中华人民共和国兽药典》二部附录2201测定。结果见表3。表3三批样品浸出物测定结果批号浸出物含量（%）平均值（%）RSD(%)202310014.014.064.034.11.14.144.104.05202310024.114.154.094.10.574.154.104.13202310034.084.164.104.10.734.124.094.07批间均一性4.1RSD=0.10%（n=18）三批样品中的浸出物平均值为4.1%，符合兽药典不能少于2.5%的规定。试验结果表明，批内均一性、批间均一性均符合要求，证明本品工艺稳定。虑实验室间检测误差等因素，浸出物标准在平均值的基础上下调至80%左右，定为浸出物不得少于3.0%。8含量测定参考文献方法，茯苓多糖在硫酸作用下脱水生成糠醛衍生物，与苯酚生成橙红色物质，在490nm有最大吸收，用紫外-可见分光光度法测定，对照品比较法定量。8.1仪器设备紫外-可见分光光度计；分析天平：感量0.1mg，0.01mg。8.2试剂或材料除非另有规定，仅使用分析纯试剂。水：符合GB/T6682，一级水。50%硫酸：取硫酸50mL，用水稀释至100mL。5%苯酚：取苯酚5mL，用水稀释至100mL。对照品溶液的制备：取经105℃干燥至恒重的D-无水葡萄糖对照品10mg，精密称定，置100mL量瓶中，加50%硫酸使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。8.3分析步骤8.3.1供试品溶液制备取本品约10mg，精密称定，置100mL量瓶中，加50%硫酸溶液适量，密塞，用力振摇，超声处理10分钟使溶解，加50%硫酸溶液稀释至刻度，摇匀。再精密量取2mL于10mL量瓶中，用50%硫酸溶液稀释至刻度，摇匀作为供试品溶液。8.3.2测定分别精密量取供试品溶液及对照品溶液各2mL置20mL具塞试管中，分别加入5%苯酚1.8mL，充分混合后，再分别缓慢加入6mL硫酸，立即混匀，25℃水浴40min，取出，以相应试剂作空白参比，在490nm波长处测定吸光度，即得。8.4测定方法优化⑴测定波长的选择取D-葡萄糖对照品和茯苓样品粉末适量，精密称定，照4.2.6.2对照品溶液制备方法和4.2.6.3.1供试溶液制备方法制备，分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液、纯化水各2mL，于20mL具塞试管中，分别加入5%苯酚溶液1.8mL，充分混合后，再分别缓慢加入6mL浓硫酸，立即混匀，水浴锅内25℃放置40分钟，以纯化水反应的溶液做空白，在紫外-可见分光光度计上于400-600nm波长范围内进行扫描。结果表明，供试品溶液和对照品溶液在490nm处均有最大吸收，故选择测定波长为490nm，见图3、4。图3供试品溶液UV图谱图4D-无水葡萄糖对照品溶液UV图谱⑵反应温度选择取茯苓粉末样品，照4.2.6.3.1项下供试溶液制备方法制备20mL，精密量取10mL至50mL量瓶中，用50%硫酸溶液稀释至刻度，摇匀，取20mL具塞试管5支，分别精密量取2mL样品于20mL具塞试管中，加入5%苯酚溶液1.8mL，充分混合后，再分别缓慢加入6mL浓硫酸，立即混匀，5支试管中的样品分别在20℃、25℃、40℃、60℃、80℃水浴，水浴时间40分钟，于490nm波长测定样品吸光度值。结果显示，在25℃水浴条件下反应的溶液吸光度最强，故选择25℃为水浴温度。测定结果见表4。表4反应温度考察结果水浴温度20℃25℃40℃60℃80℃10.25050.26270.23320.22270.229820.25030.26240.23290.22180.228430.25070.26260.23250.22320.224040.25010.26170.23400.22410.226650.25100.26300.23470.22460.2259均值0.2510.2620.2330.2230.227⑶反应时间选择取茯苓样品粉末，照4.2.6.3.1项下的方法配制成供试品溶液，精密量取2mL至10mL量瓶中，用50%硫酸溶液稀释至刻度，摇匀，精密量取2mL于20mL具塞试管中，分别加入5%苯酚溶液1.8mL，充分混合后，再分别缓慢加入6mL浓硫酸，立即混匀，25℃下水浴10分钟、20分钟、40分钟、60分钟、80分钟，于490nm波长处测定样品吸光度值，结果见表5。表5反应时间考察结果水浴时间（min）10203040608010.26430.26260.26200.27110.25960.257420.26440.26300.26340.27030.26040.257830.26410.26370.26350.26980.26000.257740.26450.26350.26310.27130.25970.257050.26460.26410.26340.27040.26010.2579均值0.2640.2630.2630.2710.2600.258结果表明，茯苓多糖在水浴40分钟时，吸光度值最大，因此选择水浴时间为40分钟。苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物，再以比色法测定。结合反应时间及反应温度因素试验结果，水浴时间过长、温度过高，可能会造成糖醛衍生物与苯酚生成的中间产物不稳定。因此，本方法选用25℃下水浴40分钟的条件。⑷5%苯酚溶液加入量选择取D-葡萄糖对照品适量，照4.2.6.2项下的方法配制成对照品溶液，精密量取2mL至10mL量瓶中，用50%硫酸溶液稀释至刻度，摇匀，精密量取2mL于20mL具塞试管中，分别加入5%苯酚溶液0.2mL、0.4mL、0.8mL、1.2mL、1.6mL、1.8mL、2.0mL，再分别加入水1.8mL、1.6mL、1.2mL、0.8mL、0.4mL、0.2mL、0mL，充分混合后，再分别缓慢加入6mL硫酸，立即混匀，25℃水浴40分钟，于490nm波长测定样品吸光度值，从图表可见，5%苯酚加入量为1.8mL时，吸光度有最大值，因此5%苯酚加入量定为1.8mL。结果见表6。表65％苯酚加入量考察加入量（mL）0.20.40.81.21.61.82.010.06930.13260.21250.24680.26220.26810.220320.06900.13260.21270.24700.26280.26840.221830.06920.13250.21240.24630.26240.26870.221040.06940.13280.21260.24610.26190.26820.220750.06920.13240.21230.24640.26230.26840.2215均值0.0690.1330.2130.2470.2620.2680.221⑸硫酸加入量选择取D-葡萄糖对照品，照4.2.6.2项下的方法的方法配制成对照品溶液，精密量取2mL至10mL量瓶中，用50%硫酸溶液稀释至刻度，摇匀，精密量取2mL于20mL具塞试管中，分别加入5%苯酚溶液1.8mL，立即混匀，分别精密加入硫酸4.0mL、5.0mL、5.5mL、6.0mL、6.5mL、7.0mL、8.0mL。于490nm波长测定样品吸光度值，从图表可见，在结果表明，硫酸加入量为6.0mL时，测定结果值最大，因此硫酸加入量定为6.0mL。加入硫酸的量偏小，导致水解反应不完全，而加入硫酸过多，可能会造成糖醛衍生物与苯酚生成的中间产物不稳定。测定结果见表7。表7硫酸加入量考察加入量（mL）4.05.05.56.06.57.08.0吸光度（A）0.11840.26220.25520.26100.24300.21860.2030总体积7.88.89.39.810.310.811.8吸光度与体积乘积0.92352.30742.37342.55802.50292.47022.49698.5方法学验证⑴线性关系考察取D-葡萄糖对照品，照4.2.6.2配制成对照品溶液，精密吸取对照品溶液各1mL、2mL、3mL、4mL、5mL，分别置于5个10mL量瓶中，加50%硫酸溶液稀释至刻度，得浓度分别为10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL的溶液。精密量取2mL，置20mL具塞试管中，分别加入5%苯酚溶液1.8mL，充分混合后，再分别缓慢加入6mL硫酸，立即混匀，25℃水浴40分钟，在490nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标（Y），浓度为横坐标（X），绘制标准曲线。得回归方程为Y=0.0125X-0.0678r=0.9994，n=6)，结果见表10，D-无水葡萄糖在10.19μg/mL～61.14μg/mL范围内线性关系良好，结果见表8，回归曲线图见图5。表8D-无水葡萄糖线性关系考察结果葡萄糖对照品浓度（μg/mL）吸光度（A）10.190.060020.380.185230.540.308440.760.448550.850.574461.140.6891图5D-无水葡萄糖线性回归方程图⑵精密度试验取D-葡萄糖对照品6份，照4.2.6.2的方法配制照品溶液，分别精密量取2mL于6支20mL具塞试管中，分别加入5%苯酚溶液1.8mL，混匀，分别加入硫酸6.0mL，立即混匀，25℃水浴40分钟，于490nm波长测定样品吸光度值。结果见表9。计算其吸光度与重量的比值，RSD值为0.16%，表明该方法精密度良好。表9精密度试验结果试验号123456对照品重量10.1910.2110.2410.2010.2110.22吸光度（A）0.30640.30740.30850.30810.30810.3082吸光度/重量0.030070.030110.030130.030210.030180.03016RSD（%）0.16⑶稳定性试验取茯苓供试品粉末适量，照4.2.6.2的方法配制成供试品溶液，取20mL具塞试管6支，分别精密量取供试品溶液2mL，分别加入5%苯酚溶液1.8mL，混匀，分别加入硫酸6.0mL，立即混匀，25℃水浴40分钟，取出，暗处放置0、10、20、40、80、120分钟，于490nm波长处测定样品吸光度值，结果见表23。计算吸光度的RSD值为1.66%，表明供试品溶液在制备120分钟内稳定性良好。表10稳定性试验结果放置时间（min）010204080120吸光度（A）0.3330.3390.3450.3440.3480.347RSD（%）1.66⑷重复性试验取茯苓供试品粉末适量，精密称取6份，每份约10mg，照4.2.6.3.1的方法配制供试品溶液，分别精密量取各供试品溶液2mL，分别加入5%苯酚溶液1.8mL，混匀，分别加入硫酸6.0mL，立即混匀，25℃水浴40分钟，于490nm波长测定样品吸光度值，计算含量。结果见表11，样品中总多糖的平均含量为74.09%，RSD为0.92%，表明本方法重现性好。表11重复性试验结果试验次数总多糖含量（%）±SD(%)RSD(%)173.8574.09±0.770.92274.77374.84474.57573.60672.90⑸加样回收率试验取批号为20231001的样品，称取9份，每份约5mg，精密称定。分别加入D-无水葡萄糖对照品约5mg，照4.2.6.2的方法制成供试品溶液。再精密量取各供试品溶液2mL，分别加入5%苯酚溶液1.8mL，混匀，分别加入硫酸6.0mL，立即混匀，25℃水浴40分钟，于490nm波长测定样品吸光度值，计算回收率。结果见表12，平均回收率为99.31%，RSD为1.12%，表明方法回收率良好。表12加样回收率试验结果供试品号称样量（mg）含多糖量（mg）加入量（mg）实测量（mg）回收率（％）（%）RSD（％）15.123.30544.127.300098.5199.311.1225.213.38114.027.356699.4734.973.17934.057.010497.3445.213.38114.988.4481100.9355.203.37274.948.185198.6365.283.44005.098.5576100.2975.093.28026.049.215998.9985.123.30545.999.3438100.4795.133.31386.019.245499.24⑹样品的测定取茯苓三批（批号20231001、20231002、20231003），每批样品30g，研细，取6份，每份约10mg，精密称定，照4.2.6.2的方法制成供试品溶液，分别精密量取各供试品溶液2mL，分别加入5%苯酚溶液1.8mL，混匀，分别加入硫酸6.0mL，立即混匀，25℃水浴40分钟，于490nm波长测定样品吸光度值，计算含量。结果见表13。表13三批样品总多糖含量测定结果批号总多糖含量（%）平均值（%）RSD（%）2023100173.8574.7774.8474.090.9274.5773.6072.902023100272.9673.7072.2572.840.9171.7172.9073.522023100374.7872.3074.4273.851.0974.0973.2574.25批间均一性=73.59%RSD%=1.10（n=18）根据上述含量测定结果，考虑到药材的来源及质量差异，以及药材生产储藏等因素的影响，在平均值的基础上下调至80%左右，故暂定本品按干燥品计算，含总多糖以D-无水葡萄糖(C6H12O6)计，不得少于60.0%。9贮存和有效期9.1贮存取茯苓块（批号：23040801），按照《中华人民共和国兽药典》一部附录9001【原料药物与制剂稳定性试验指导原则】执行，进行稳定性研究影响因素试验，包括高温、高湿及强光照射试验。结果见表14。表14样品稳定性试验影响因素试验结果表影响因素时间（天）性状吸湿性（%）总多糖（%）//0白色074.12高温5白色减重4.4374.7910白色减重6.2875.06高湿（75%）5白色增重13.5774.4610白色增重20.8574.19强光5白色减重2.4375.0310白色减重3.5774.89结果表明：本品易吸潮，同时在高温及强光照射下，性状、含量稳定。因此本品贮存条件应置干燥处、防潮。9.2有效期规定在符合规定的贮存和运输条件下，贮存期与标签标识一致，即各生产企业自行规定有效期。